赵勇¹   曾泉²    陈静¹  陈治清¹

 

目的 构建三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架，用于骨组织工程。

方法 综合运用丝素蛋白纤维网的非编织制作方法和仿生矿化法，构建三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架。通过体外蛋白酶降解和成骨细胞培养，考察其生物学性能。

结果 蛋白酶对丝素蛋白降解的作用大小依次为，蛋白酶K>胰蛋白酶>α-糜蛋白酶>I型胶原酶。所构建的支架显示出良好的生物相容性并能促进成骨细胞生长和分化。

结论 三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石支架可望成为新型有机/无机复合生物材料，为组织工程支架的设计提供了新的思路。

[关键词] 丝素蛋白 仿生矿化 细胞培养 骨组织工程支架

 

Objective: To evaluate the biological characteristics of the 3D non-woven silk fibroin net / nano-HAP (NSFN/nHAP) scaffolds used in bone tissue engineering.

Methods:In vitro experiments were carried out to investigate the enzymatic degradation of the scaffold. Osteoblast cultivation was tested by SEM, MTT and ALP to evaluate the biological reaction of the scaffold.

Results: Silk fibroin is biodegradable. Enzymatic degradation of fibroin indicated that the extent of weight loss depended on the type of enzyme, the enzyme-to-substrate ratio, and the treatment time. Among the enzymes, protease K was the most aggressive and followed by trypsin, α-chymotrypsin and collagenase I. The protease K solution with the concentration of 0.3mg/ml almost caused a complete weight loss within 20 days of incubation. NSFN/nHAP showed an excellent cytocompatibility for the growth of osteoblasts and had the capabilities to improve the viability of osteoblasts.

Conclusion:Porous NSFN/nHAP scaffold may be a hopeful scaffold used in bone tissue engineering.

[Key words]  Fibrion Biomineralization Cell cultivation Degradation

Bone tissue engineering  

 

    蚕丝纤维所具有的独特性能能够满足生物支架材料的多方面的要求：蚕丝具有较高的强度和柔性，对水和氧的通透性好，可以制成纤维、海绵或膜。这些特点使得蚕丝可望成为优良的基质材料应用于生物医学[1]。理想支架材料的筛选和应用是骨组织工程研究的重要内容。丝素蛋白在骨组织工程方面的应用需要解决丝素蛋白支架的设计和生物学性能这两个主要问题。本文通过体外降解和细胞培养等方法，对非编织丝素蛋白/纳米羟基磷灰石支架（NSFN/nHAP）进行生物学效应的实验研究。

 

1 材料和方法

1.1材料

    NSFN/nHAP 支架（自备），蚕丝（双宫丝，成都天友丝绸公司），纤维素半透膜（分子透过水平8000-15000道尔顿，德国），SD新生乳鼠，新生小牛血清等（四川大学华西口腔医学院卫生部重点实验室提供）；F-12培养基(Gibco，NY, USA)； MTT (Amresco，USA)；PBS液；碳酸氢钠；0.25％胰蛋白酶；I型胶原酶(Gibco，NY, USA)；蛋白酶K（ACT:39.5U/MG, AMRESCO）；α-糜蛋白酶（效价≥400单位/mg，中国上海化学试剂公司）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。恒温培养箱等细胞培养器具；高效分析仪(Bio Assay Reader, HTS7000 Plus，美国)；倒置相差显微镜(IX50/IX70, Olympus，日本)等。

 

1.2 方法

1.2.1丝素蛋白（SF）的体外蛋白酶降解实验

    采用失重法观察不同的蛋白酶在体外对SF的降解作用。蚕丝经脱胶、溶丝、透析等步骤制成厚约1mm的丝素蛋白膜，80°C，6h干燥，称重待用。每种蛋白酶分别采用a、b两种不同的浓度进行实验。其中蛋白酶K（PRO）的浓度为0.3mg/ml(a)、0.1mg/ml(b)，I型胶原酶（COL）、α-糜蛋白酶（CHY）、胰蛋白酶（TRY）等均为1mg/ml(a)、0.5mg/ml(b)。将SF膜（每片约10mg）分别置于培养瓶中（n＝5）；每个培养瓶中注入蛋白溶液2.5ml。37°C恒温水浴20天，不含蛋白酶的PBS作为对照。每天换液1次，分别在降解过程的1、5、10、15、20天弃浸泡液，蒸馏水漂洗SF膜，干燥称重。各个时间点丝素蛋白重量减少的百分率按下列公式计算：

    失重率＝(SF降解前重量－SF降解后重量)/SF降解前重量×100％

    每组计算结果求均数得降解后的失重率[2, 3]。

 

1.2.2 NSFN/nHAP的制备

    蚕丝（双宫丝，成都天友丝绸公司）经脱胶处理，采用甲酸/氯化钙表面溶解的方法制备非编织支架结构[4]，然后交替矿化获得NSFN/nHAP支架。实验所用NSFN/nHAP为5个矿化周期形成的复合支架[5]。

    支架经充分漂洗后室温干燥，修整成与24孔及12孔培养板孔径一致的圆片，环氧乙烷消毒，无菌PBS漂洗后，置入培养板中待用。

 

1.2.3体外细胞培养

    采用组织块原代培养方法，分离培养成骨细胞。经5次传代，充分增殖后，用培养液稀释配制成5×104个/ml的细胞悬液。根据分组需要将细胞悬液加入到相应的24孔板，每孔1ml。12孔板每孔接种2ml细胞悬液。分组方法：细胞与NSFN/nHAP支架共培养为实验组，细胞与NSFN共培养为阳性对照组，细胞在培养板中培养作为空白对照组，每组28个样本。

 

1.2.4体外细胞培养的检测方法

    分别在培养的1、3、5、7天收集标本，进行MTT检测。用SPSS10.0软件进行组间两两比较和统计分析。统计方法为LSD，t检验。

    共培养的第3天和第7天进行SEM观测。样本处理方法：弃培养液，用2.5％的戊二醛固定4h，酒精梯度脱水，醋酸异戊脂浸泡过夜，临界点干燥后，喷金待检。

共培养的第3天和第7天，收集12孔板中NSFN/HA支架材料上培养的成骨细胞，进行碱性磷酸酶（ALP）活性检测。

 

2结果

2.1 SF体外蛋白酶降解

    SF的酶水解呈现以下特点：1）SF的降解与蛋白酶种类有关。2）SF的降解与蛋白酶的浓度、酶解时间呈正相关关系。3）蛋白酶K对丝素蛋白水解作用最为强烈。当蛋白酶K为其它蛋白酶浓度的1/10（即0.1mg/ml）时，对SF降解的效果分别是I型胶原酶的3.6倍、是α-糜蛋白酶的1.6倍、比胰蛋白酶对SF的降解率高出6％。蛋白酶对SF降解的作用大小依次为，蛋白酶K>胰蛋白酶>α-糜蛋白酶>I型胶原酶（图1）。

2.2成骨细胞与两种支架共培养形貌特征

    培养3天时，两种支架上的细胞数目较少。SEM可见细胞顺着丝纤维所构成的三维孔隙边缘攀附、包裹于支架上，并爬行进入孔隙的内部。此时三维NSFN/nHAP纤维骨架清晰可见。

    培养7天后，成骨细胞数量明显增多。低倍镜下，整个丝纤维骨架己经被苔藓般密集排列的细胞缠绕。细胞增殖铺展，似“叠瓦”状排列并跨越多孔纤维支架的孔隙和间隔，覆盖在支架表面。此时支架已隐藏于密集的细胞群落之中（图2b）。高倍镜下可见：成骨细胞紧密贴附于NSFN/nHAP支架的表面。细胞伸出许多伪足并分泌大量的细丝状胶原（图3）。

 

2.3 MTT检测

    实验组和对照组的成骨细胞随着培养时间的延长而增殖。培养的第3天，NSFN组的细胞数量高于实验组及空白组(p<0.05)。培养第5天时，3组材料上的细胞增殖量均达到第1天的2倍左右，但各组细胞量没有统计学差异。1周后，成骨细胞在NSFN和NSFN/nHAP支架材料上生长更为活跃，与空白组对照，具有统计学差异(p<0.05)。说明NSFN和NSFN/nHAP均具有促进成骨细胞生长的性能（图4）。

2.4 ALP检测

    ALP检测结果统计分析方法同上。成骨细胞培养的第3天，空白对照组与实验组的细胞ALP活力没有统计学差异(p>0.05)。至细胞培养的第7天，实验组和阳性对照组的ALP值均比培养3天时增高3倍左右。NSFN/nHAP组ALP值的增高尤为突出。各组间均存在显著的统计学差异(p<0.05)。

 

 

3 讨论

    文献证明：不同种类的蛋白酶对SF降解作用不尽相同，不同形貌的SF（如SF膜、SF海绵或NSFN）在同一种蛋白酶作用下，也有不同的降解效果，而体内情况更为复杂。SF的降解实际上是多种酶、不同的理化环境等多种因素协同作用的结果[6]。尽管如此，通过简化实验方法，了解其基本的降解规律，有利于尽快优化设计支架材料。

    关于SF的降解，除了本实验所用的蛋白酶外，激酶（actinase）、羧化酶（carboxylase）、蛋白酶E、蛋白酶XXI等都曾用于考察SF的降解。一般认为，糜蛋白酶作用于丝素蛋白纤维的无定型结构区域，并可提高丝素的结晶度，蛋白酶E也作用于丝素蛋白的无定型区。Minour在实验中发现，蛋白酶XIV，不但能够溶解丝素蛋白，还能直接将丝素蛋白分解为多肽和氨基酸，15天内，70％的丝素蛋白海绵即可被1.0 U/ml的蛋白酶XIV降解[3, 6]。本实验结果与Minour和Arai的实验基本一致。

    Unger[7]在NSFN上进行为期7周的人体细胞培养。这些人体细胞包括：内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、角化细胞、骨肉瘤细胞。实验发现所有种类的细胞均可在丝素蛋白纤维网上粘附和铺展。细胞分裂、增殖，铺展于单个纤维的表面。大多数细胞在非编织的丝蛋白网上至少能够生长7周。角化细胞和骨肉瘤细胞在丝素蛋白纤维网上的生长尤其旺盛，预示SF可能用作生物材料重建骨组织和皮肤。

    其他研究也证实成纤维细胞在SF上附着状态是理想的，SF有利于细胞的分化、生长和功能表达[8, 9]。

    本实验中，成骨细胞数量在培养1周后明显增加，分布更均匀。细胞首先沿着丝素蛋白纤维攀附生长，并能够经三维多孔的孔隙深入到支架材料的内部。细胞在支架的表面重叠，基质堆积，开始跨越丝素蛋白纤维之间的孔隙间隔，并封闭载体表面的部分孔隙。尽管如此，由于本实验所用的NSFN三维多孔支架的孔隙度控制在78％，孔径平均值约为177.9μm，这种结构尺度适宜成骨细胞的生长。至培养1周以后，成骨细胞虽生长旺盛，铺展密集而重叠，但是支架表面仍然预留许多孔隙。这对于在继续培养细胞的过程中，保持支架材料的通透性，使支架内部的细胞能够充分获得所需要的营养物质，为保证细胞生长的正常代谢提供了良好的条件。这也是NSFN/nHAP支架材料的优点所在。

    此外，骨细胞对新的生长环境非常敏感，支架材料表面的材料构成成分、表面能、粗糙度、表面形貌等都可能影响接种骨细胞的骨形成的进程。其中，表面形貌和微观结构粗糙度是影响细胞粘附、生长和成骨的主要因素。NSFN/nHAP支架的表面是仿生矿化形成的纳米级磷灰石晶体结构[10]，纳米材料比表面积大，有利于功能性蛋白的附着和细胞的粘附。这种微观结构实现了支架设计中所追求的多等级结构(hierarchical structure)，也为成骨细胞的生长提供了有利的环境。

 

4．结论

    SF的降解与蛋白酶种类有关。SF的降解与蛋白酶的浓度、酶解的时间呈正相关关系。仿生矿化的NSFN支架在体外细胞培养时，能促进成骨细胞的生长和分化。本研究综合运用仿生矿化和非编织丝素蛋白纤维网的制作技术，成功合成了非编织的三维多孔丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架材料。体外实验初步证明，该支架材料具有良好的生物相容性，可生物降解，加工成型容易。该支架材料的优化设计和性能仍待进一步探讨。

 

 

 

[5] 赵勇. 仿生合成丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的骨组织工程研究. 四川大学口腔医学博士学位论文（10610/B030844）.2006：P46-60