赵勇1 李罡2 陈静1 陈治清1
基金项目：国家863课题 (编号:2002AA326080)
丝素蛋白/纳米羟基磷灰石支架的实验研究
[摘要]
目的 设计和构建三维丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架材料。方法 联合运用丝素蛋白非编织方法和仿生矿化技术，制备并表征三维多孔丝素蛋白/纳米羟基磷灰石的有机/无机组织工程支架。结果 仿生矿化在非编织支架上所形成的针状羟基磷灰石晶体，直径约20～60nm，长约100～300nm。复合支架孔隙度约为70-78％，孔径为163±40.0μm。结论 采用非编织丝素蛋白和仿生矿化的方法可制备出在孔隙度和孔径可控的组织工程支架。
[关键词] 丝素蛋白 仿生矿化 羟基磷灰石 骨组织工程
Simple Preparation and Characteristics of 3D Non-woven
Silk Fibroin/nano-HA Scaffolds
[Abstract]
Objective: To design and fabricate the three dimensional (3D) porous structure of silk fibroin/apatite. Methods: With the combining use of non-woven silk fibroin net and biomimetic method, porous non-woven silk fibroin/nano-HA net (NSF/HAN) was prepared and characterized. Results: The scaffold fabricated in the present study exhibited the porous micro structure with open porosity around 70–78%. Its average pore size was about 163±40.0μm. The swelling ratio and water uptaking were 4.555 and 81.928%, respectively, which revealed that the 3D porous scaffold had an excellent hydrophilicity. The rod-shaped apatite crystals could rapidly form on the surface of fibroin fibers throughout of the network. The nano-sized hydroxyapatite crystals were needle-like with the length of about 100-300nm and the diameter of some 20-60 nm. Conclusion: A 3D porous NSF/HA scaffolds can be fabricated by biomimetic mineralization.
[Key words] Fibrion Biomineralization Hydroxyapatite Bone tissue engineering
理想支架材料的研究和运用关系到骨组织工程的发展。支架材料在骨组织工程中，为新生骨组织提供生长所需的三维空间和力学支持。蚕丝丝素蛋白属于一种天然的纤维蛋白。丝素蛋白具有优良的生物相容性和力学性能。可以缓慢降解，在医药和生物技术等方面已有广泛应用，取得了一些可喜的成果[1,2]。现阶段将蚕丝蛋白应用于骨组织工程的相关研究主要停留在丝素蛋白的生物相容性方面，合成复合材料的方法还十分有限[3,4]。所合成材料的结构特性还不能满足骨组织工程支架材料或骨替代材料的要求。
本文旨在研究丝素蛋白的矿化行为，并通过仿生矿化来制备三维多孔非编织丝素蛋白/羟基磷灰石支架，用于骨组织工程。
1 材料和方法
1．1主要原料和仪器设备
蚕丝（双宫丝，成都天友丝绸公司）,碳酸钠，无水氯化钙，无水乙醇，98%甲酸，无水甲醇，碳酸氢钠，三羟甲基胺基甲烷等。涡流振荡器，真空干燥箱，X光衍射仪；傅立叶变换红外光谱仪；扫描电镜等。
1．2 方法
1．2．1非编织丝素纤维网(non-woven silk fibrion net，NSFN)的制备
NSFN的制备参考了Armato的方法[5]。蚕丝经脱胶、脱脂处理后，浸入含氯化钙的甲酸溶液。甲酸浓度为98％。CaCl2在甲酸中的含量为0.01％(w/v)。蚕丝与溶液之比为1：200（w/v）。蚕丝在振荡分散后，干燥漂洗待用。
1．2．2 NSFN/HA复合材料的制备
NSFN经新鲜配制的饱和氢氧化钙溶液(pH 12.4)预矿化浸泡3d天后，采用交替矿化的方法仿生矿化NSFN[6]。基本步骤为：去离子水清洗后首先把样本浸泡于0.1M CaCl2 Tris缓冲溶液中，恒温水浴37°C，12h，取出后再以去离子水洗涤，然后浸泡于0.1M Na2HPO4 Tris缓冲溶液，恒温水浴37°C，12h。此过程即为矿化的一个周期。参考交替矿化相关文献，分别于1、3、5、8个交替矿化周期结束后，采取样本，自然干燥，检测。
1．2．3 表征方法
使用SEM，XRD，FTIR等检测材料的形貌、结构特性，并表征材料的孔隙率、孔径大小、吸水膨胀性。
2 结果
2．1 NSFN/HA复合材料的形态、结构特征
NSFN的多孔形貌见图1。蚕丝在甲酸溶液中分散均匀后，纤维表面在浸泡过程中发生部分溶解，相互交织、粘连。溶液蒸发后蚕丝沉积形成三维多孔的非编织网状结构。
NSFN经Ca(OH)2预矿化处理后，采用交替矿化法沉积磷灰石。矿化第1个周期后，钙磷沉积物即覆盖于NSFN表面，晶体颗粒细小，分布均匀，排列密集。横截面的SEM图像可见：矿化后，沉积的晶体均匀分布在丝素蛋白纤维孔隙的内外表面。由此说明，交替矿化法能够在NSFN的孔隙外表和孔隙内部的丝素蛋白纤维表面形成并沉积矿化物（图2c、2d）。该方法对于三维多孔NSFN的仿生矿化是行之有效的。
随着矿化周期的增加，矿化晶体在原有钙磷沉积物的基础上进一步沉积和生长，晶体颗粒逐渐变得有序和规则，最终形成的针状矿化晶体，直径约20～60nm，长约100～300nm。实验发现，磷灰石晶体随着矿化进一步长大，覆盖于整个NSFN表面并层层堆积，充塞到NSFN的孔隙当中。
图1： NSFN的SEM形貌（a：×200，b：×1000）。圆圈内显示三根丝纤维相互融合的交汇点。
Fig.1: SEM shows the structure of none-woven silk fibroin net (a: ×200，b：×1000).
Structure in the circle exhibits the several surface-dissolved silk fibers conglutinate with each other and thus formed the none-woven net.
图2：NSFN交替矿化第3个周期（a，b），以及第8个周期（c，d）的SEM形貌。
a，c放大倍数分别为×5,000和×10,000，b，d为×30,000
Fig.2: SEM displays the appearance after 3 cycles (a, b) and 8 cycles (c，d）of NSFN mineralization.
(a＆c: ×5,000 ＆ ×10,000; b＆d: ×30,000)
2．2 XRD分析
XRD检测测试条件为：Cu的Ka辐射，40kV，40mA，2θ从10º－60º进行扫描（步长为0.02°，设置时间为5s）。结果显示，NSFN随着矿化周期的增加，羟基磷灰石的特征峰逐渐加强。至矿化的第四个循环周期，2θ＝25、，2θ＝30－35等处，均可见HAP典型的[002]和[211]等衍射峰。经Rietveld法精修后[7]，可以观测到交替矿化第3个周期以后，样本上沉积的磷灰石晶体数值即与HA的理论计算结果相吻合。
随着矿化周期的增加，晶胞参数在矿化过程中发生了一定的变化。在预矿化组，形成的磷灰石晶胞参数值从a＝9.43627 Å到9.44443Å；c＝6.88599Å增加到6.88871 Å；微晶尺度随着矿化周期的增加而显著增大：a＝70.00811Å到147.91731 Å，c＝154.44452到188.89171 Å。磷灰石结构随矿化过程逐渐趋向完善，微晶尺寸增加，微观应力减小。拟合结果数值判断的加权谱图R指标（R-weighted pattern）在不同矿化时段均在理想值10％左右，说明矿化形成磷灰石，Rietveld结构的精修结果准确。
2．3 FTIR分析
红外光谱检测结果显示，交替矿化后，丝素蛋白的C-N键1065 cm‑1处出现PO43‑的吸收峰，说明磷灰石的磷酸根与C-N基团结合，形成PO43－基。处理次数增加，该处的PO43‑的吸收峰也随之显著增强。同时，在603 cm‑1和564 cm‑1区段呈现出显著而锐利的磷酸根特异性吸收双峰，表明磷灰石在仿生矿化的过程中与丝素蛋白结合，形成矿化沉积的晶体。FTIR结果说明磷灰石在仿生矿化的过程中与丝素蛋白相互作用，矿化沉积的晶体以磷酸根和C-N结合位点所形成的晶核为核心生长。
2．4 孔隙度
采用液体置换的方法检测NSFN的孔隙度。文献报道：正己烷很容易渗透到蚕丝蛋白纤维的孔隙中，而且渗透到孔隙的过程中不会引起蚕丝蛋白支架的皱缩或膨胀，因此适合用来测试蚕丝蛋白孔隙度。交替矿化的过程中，孔隙度的变化趋势与矿化周期成反变关系。未矿化时的孔隙度为77.88％，矿化的第3、5、8个周期，各组孔隙度检测的平均值依次为77.36％、74.59％和70.14％。经组间两两比较和统计分析,各组间存在统计学差异（p<0.05）。统计方法为LSD（Least significant difference），t检验。
2．5 孔径测试
试样采用图像分析软件（SMileView Ver2.1）测量了NSFN孔隙的孔径大小。
结果见表1。统计分析表明，交替矿化第4和第8周期，导致孔径的减小，矿化后的孔径的平均值与未矿化组存在统计学差异（p<0.05）。
表1
NSFN矿化第四和第八个周期的孔径测量结果：
Table 1: The porosity of NSFN , after 4 and 8 cycles of mineralization.
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（单位：μm）
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NSFN
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NSFN-4C
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NSFN-8C
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最大值(Max.)
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265.0
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240.0
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208.4
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最小值(Min.)
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104.0
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96.7
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43.5
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平均值(Ave.)
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177.9
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163.4
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112.7
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标准差(SD)
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40.0
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42.6
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41.7
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2．6 泡胀比（swelling ratio SR）和摄水率（water uptaking WU）
泡胀比和摄水率反映了支架材料的吸水性或亲水性[8]。检测方法：室温下，将NSFN浸泡到蒸馏水中24h，取出后滴去多余水分，称重得到NSFN湿重（Ws）。然后把样本真空干燥，65°C，12h。再进行称量得到NSFN的干重（Wd）。
泡胀比和摄水率的计算公式如下：
SR＝（Ws－Wd）/Wd
WU＝[(Ws－Wd)/Ws]×100％
泡胀比和摄水率最后计算的平均值分别为4.555和81.928％。
3 讨论
目前制备组织工程支架材料的方法虽然较多，但各种方法和材料制备的支架在理化及生物学性能上都各自存在着一定的局限和问题，利用丝素纤维设计制备组织工程支架，构建性能更好的骨组织工程多孔支架，仍然是未来的研究课题[9，10]。
有关丝蛋白纤维的矿化，学者们曾尝试了不同的矿化方法。由于丝蛋白纤维的种类不同，矿化的方法不同，所得的结果也各有差别。
Takeuchi[3]采用1.5×SBF，对未经脱胶处理的蚕丝生丝、经脱胶处理的蚕丝、以及丝胶蛋白膜三种基质材料进行仿生矿化的对比。实验发现，未脱胶处理的生丝，CaCl2溶液预矿化后，在1.5×SBF中浸泡7天，即可在生丝的表面沉积磷灰石。磷灰石沉积的量与预矿化液的钙离子浓度有关，沉积量随着预矿化时使用的CaCl2溶液浓度的增高而增多。丝胶蛋白膜仿生矿化时也能沉积磷灰石。而蚕丝经脱胶后的丝素蛋白基质，即使在仿生矿化前使用5M的CaCl2预矿化，在1.5×SBF溶液中浸泡一周也未见磷灰石的形成。因此认为：丝胶蛋白能促进仿生矿化过程中磷灰石的沉积；预矿化处理有利于提高磷灰石的沉积量；在1.5×SBF条件下，不能实现对丝素蛋白的仿生矿化。究其原因，是酸性氨基酸的含量差异所致。丝胶中含有丰富的酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸），约为20mol％，而丝素蛋白仅有3mol％。酸性氨基酸中的羧基易于与钙离子结合形成－COOCa＋或(－COO)2Ca。因而有利于在基质表面异相成核，促进磷灰石的沉积。
尽管丝胶蛋白能够促进磷灰石的仿生矿化沉积，有利于合成有机物复合材料，但是由于丝胶存在自身的免疫原性，植入体内后会引发机体的变态反应，所以，丝胶不能作为骨的替代材料或骨组织工程材料。与此相反，丝素蛋白却没有这种抗原性，植入体内后不会引发机体的变态反应，同时还具备丝蛋白作为生物材料的一般优点（可降解性，降解终产物为氨基酸，具有较好的机械强度），因此，在骨缺损修复材料的研究中，重新选择一种对丝素蛋白进行仿生矿化可行方法，是合成新型的丝素蛋白复合材料的重要内容。
本实验所采用的方法，能够快速实现丝素蛋白纤维的矿化。在交替矿化的第一个周期（24小时），即可在NSFN的表面沉积磷灰石，纳米级的晶体均匀覆盖于SF纤维的表面。笔者在该项研究的初期即经实验证实，交替矿化方法在SF膜上仍可实现生物矿化[11]。SEM、XRD、FTIR等检测结果均说明，NSFN交替矿化比SF膜的矿化速度更快，矿化循环进行的第4个周期，NSFN上即可形成晶化完善的羟基磷灰石。虽然FTIR所示的NSFN和SF膜在分子结构上差别不大，但两者的宏观结构和表面的微观形貌的差异，可能是导致这一现象的主要原因。
在组织工程里，材料的孔隙度和水的结合性能是评价生物材料特性的两个重要方面。本实验的孔隙测量结果，矿化前三维非编织丝素蛋白孔隙度为77.88％，孔径大小的为177.90±40.0μm。晶体沉积的量随矿化周期的增加而增加。孔隙度与矿化周期成反变关系。交替矿化的第4个周期所得的三维多孔复合支架材料，孔隙度约为76％，孔径为163±40.0μm。NSFN浸泡于蒸馏水24小时后，摄水率为81.93％，材料具有良好的亲水性。纳米羟基磷灰石的表面结构对于骨组织工程中骨细胞的生物相容性，也是有益的[12,13]。三维NSFN支架材料的基本特性符合骨组织工程的基本要求。有关该三维非均匀多孔的特性对仿生矿化沉积的影响，以及这种支架更为详尽的理化性能，尤其是生物学方面的特性，尚待进一步考察。
4 结论
1）蚕丝经脱胶处理得到的SF纤维，经甲酸/氯化钙溶液表面溶胀后可制备出非编织的三维多孔支架结构。这种支架结构可以根据需要制成非编织的多孔丝素蛋白膜，也能够制成外形结构复杂的不规则三维立体结构。成型方法简便易行。2）交替矿化方法能够实现NSFN的快速矿化。预计通过控制矿化液溶质的浓度以及矿化时间，可以有效控制矿化过程对三维支架的孔隙度和孔径的影响。3）联合采用非编织丝素蛋白和仿生矿化的方法是组织工程支架制备的一种有效方法，值得尝试和探索。
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